人肌球蛋白輕鏈激酶(MYLK)ELISA試劑盒
簡介
肌球蛋白輕鏈激酶也被稱為MYLK或MLCK，能使特定的肌球蛋白輕鏈，即肌球蛋白II的調(diào)節(jié)輕鏈磷酸化。它在肌肉的收縮機制中很重要。一旦有鈣離子（Ca2+）從肌漿網(wǎng)或細胞外空間涌入肌肉，平滑肌纖維的收縮就可能開始。首先，鈣會與鈣調(diào)蛋白結(jié)合。在鈣離子流入并與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后，pp60 SRC（一種蛋白激酶）導(dǎo)致MYLK的構(gòu)象改變，激活它并導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈在殘基19的磷酸化增加。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù) : 將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物MYLK，清洗后，再加入標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中MYLK的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標本溶血會影響檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從1μg/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至50ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的50ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將50ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為:  50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.563ng/mL、0.781ng/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)

抗體工作液配置
使用十分鐘前，將100×檢測化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×檢測化抗體稀釋成1×檢測化抗體工作液，根據(jù)所需用量當日配置當日使用。
酶結(jié)合物工作液配置
使用十分鐘前，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。

備 注：如待測樣本中MYLK濃度高于標準品高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù)。

人肌球蛋白輕鏈激酶(MYLK))ELISA試劑盒
結(jié)果的計算    

計算標準品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。示例數(shù)據(jù)以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。

本圖所示標準曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結(jié)果。

重復(fù)性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。

靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.39ng/mL。
特異性

該試劑盒測定可識別重組人MYLK。

其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。

人肌球蛋白輕鏈激酶(MYLK)試劑盒僅供科研使用，用于定量檢測細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中的人MYLK的含量。