細胞培養(yǎng)方法由上海通蔚實業(yè)專業(yè)提供:
進入操作時應注意先清洗雙手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作時注意無菌臺內(nèi)空間層次.手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,如果數(shù)量較多,培養(yǎng)瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作,瓶與瓶之間應相隔一定的距離,開瓶(蓋)時應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒,開開后應用燈先燒口,然后燒蓋.用完后同樣操作.整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點。
1.玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上。
2.無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈,紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時以上。
3.培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi),用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天,肉眼見無渾濁或沉淀等異物.分裝后置-20度保存。
4.消化液(pH7.8)或其它加入液,應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,分裝成支置-20度保存
5.培養(yǎng)箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應照射1小時以上,如有高溫滅菌的應按程序來菌).至少每月一次。
細胞復蘇:
1.應遵守慢凍快融的原則.先將水溫鍋調(diào)至37-37.5度,取出凍存的細胞迅速放入后交細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化。
2.在無菌臺內(nèi)將*培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶內(nèi),約5ml左右,然后用無菌吸管從凍存管內(nèi)取出細胞,置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃,使細胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
細胞傳代:
1.貼壁細胞:
對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養(yǎng)基,吸的越干凈越好,以免中和后加入的消化液,使強度減弱.50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進行消化,(根據(jù)配制強度經(jīng)驗),晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2分鐘,鏡下見細胞收縮變圓或少數(shù)脫落后,輕輕振動瓶底使細胞全部脫落,加入2-3ml*培養(yǎng)基后,輕輕吹打,使細胞基本成單個懸浮,然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內(nèi),加入*培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?span style="font-size:10.5pt">。
2.懸浮細胞:
一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi),加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),如要高濃度可先離心500rpm,5min后加入*培養(yǎng)基,輕輕吹勻后,分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
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