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ELISA試劑盒一般底物效果時刻，以10-30分鐘為宜。底物運用液有必要新鮮制造，尤其是H2O2在臨用前參加。
ELISA試劑盒進行各項試驗條件的挑選是很首要的，其間包含:
固相載體的挑選：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。
其方法可所以凹孔平板、試管、珠粒等。現在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何種載體，在運用前均可進行挑選：用等量抗原包被，在同一試驗條件下進行反響，查詢其顯色反響是不是均一性，據此判明其吸附功用是不是超卓。
包被抗體（或抗原）的挑選：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，央求純度要好,吸附時一般央求PH在9.0～9.6之間。
吸附溫度，時刻及其蛋白量也有必定影響,一般多選用4℃ 18～24小時。
蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不一樣的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相一同，查詢陽性標本的OD值。
ELISA試劑盒挑選OD值zui大而蛋白量起碼的濃度。
對于大都蛋白質來說一般為1～10μg/ml。
酶符號抗體作業濃度的挑選：首先用直接ELISA法進行開端效價的滴定（見酶符號抗體部份）。
然后再固定其它條件或選用“方陣法”（包被物、待檢樣品的參看品及酶符號抗體分別為不一樣的稀釋度）在正式試驗體系里地滴定其作業濃度。
酶的底物及供氫體的挑選：對供氫體的挑選央求是價廉、安全、有明顯地顯色反響，而自身無色。
有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌效果，應留心防護。
ELISA試劑盒有條件者應運用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是現在較為滿意的供氫體。
底物效果一段時刻后，應參加強酸或強堿以連續反響。