近年來,隨著免疫學(xué)的不斷發(fā)展以及ELISA試劑盒檢測技術(shù)的應(yīng)用,對雙歧桿菌的鑒定和檢測已從傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法發(fā)展到應(yīng)用以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的各種酶免疫檢測方法。在所有以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測方法中,酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是目前發(fā)展zui為迅速并且較為完善的檢測方法。
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記,根據(jù)酶反應(yīng)底物顯色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于利用了酶的率催化反應(yīng),間接放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測定具有*的靈敏度。而且,ELISA檢測是在微量板中進(jìn)行的,可以對大量樣品同時進(jìn)行檢測,節(jié)省了時間。ELISA法中的雙抗體夾心方法是常用來檢測抗原的方法。目前所報道的相關(guān)研究中,都未能對利用雙抗夾心ELISA方法檢測雙歧桿菌的反應(yīng)條件進(jìn)行建立并且沒有對雙歧桿菌進(jìn)行定量檢測的研究。ELISA方法克服了傳統(tǒng)平板計數(shù)法的繁瑣及分子生物學(xué)檢測方法的費用昂貴等缺點,如能開發(fā)出其檢測雙歧桿菌的試劑盒將對實際應(yīng)用將具有重要意義。
故此,建立本課題展開這方面的研究。 本課題中,自制并獲得了價免疫血清;建立并優(yōu)化了雙抗夾心ELISA檢測雙歧桿菌的方法;用建立起的ELISA法組裝試劑盒,對試劑盒進(jìn)行方法學(xué)評價,非雙歧桿菌屬微生物對本試劑盒的檢測結(jié)果無影響,重復(fù)性良好,對雙歧桿菌的zui低檢出限為106cfu/mL（g）;檢測時間為4h;用此試劑盒檢測市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）進(jìn)行檢測時,與傳統(tǒng)菌落計數(shù)方法相比,兩種檢測方法檢測結(jié)果差異不顯著（p0.05）;用此試劑盒對自制含雙歧桿菌的乳粉產(chǎn)品（1）進(jìn)行檢測時,與傳統(tǒng)菌落計數(shù)方法相比,兩種檢測方法檢測結(jié)果差異顯著（p0.05）。
ELISA試劑盒具體研究結(jié)果如下:
1.免疫血清的制備 制備出的兔抗長雙歧桿菌免疫血清效價可達(dá)1:20480;鼠抗長雙歧桿菌免疫血清效價達(dá)1:10240,均具有較高的效價。
2.雙抗夾心ELISA方法檢測雙歧桿菌zui適反應(yīng)條件的建立 通過對雙抗夾心ELISA檢測方法中各反應(yīng)條件進(jìn)行摸索和比較,確定*反應(yīng)條件為:*包被抗體和二抗反應(yīng)濃度分別為1:160和1:5120;選用NBS和1%BSA-PBS分別作為包被緩沖液和封閉緩沖液;封閉30min;酶標(biāo)抗體作1:2000的稀釋之后作用90min;zui后底物反應(yīng)時間為20min;并且繪制了此方法檢測雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出了標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.4461x-2.1503,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9881。
3. ELISA試劑盒的組裝 試劑盒主要組分有:兔抗長雙歧桿菌免疫血清包被并封閉的8×12孔酶標(biāo)板;工作濃度鼠抗長雙歧桿菌免疫血清;工作濃度酶標(biāo)抗體;長雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)品;底物溶液;終止液;濃縮洗滌液;操作方法及說明。
4.試劑盒的方法學(xué)評價 對所組建的雙抗夾心ELISA檢測雙歧桿菌的試劑盒進(jìn)行了方法學(xué)評價,包括:特異性、重復(fù)性、靈敏度。對分別含有4種不同雙歧桿菌和七種不含雙歧桿菌的樣品進(jìn)行檢測,非雙歧桿菌屬微生物對檢測結(jié)果沒有影響,說明此方法具有較強(qiáng)的特異性;用五種不同樣品對板間及板內(nèi)分別做了重復(fù)性實驗,僅有很好的幾分樣品變異系數(shù)超過10%,說明此試劑盒具有良好的重復(fù)性;對雙歧桿菌的zui低檢出限為106cfu/mL;
5.試劑盒的保存期實驗 通過對包被酶標(biāo)板的保質(zhì)期進(jìn)行測定,實驗證明,此試劑盒能在4℃的條件下保存一年以上; 6.試劑盒在雙歧桿菌檢測中的應(yīng)用 采用所組建的雙歧桿菌雙抗夾心ELISA試劑盒對市售雙歧桿菌的酸奶、奶粉及自制雙歧桿菌乳粉進(jìn)行檢測與平板計數(shù)法相比。用此試劑盒檢測市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）進(jìn)行檢測時,與傳統(tǒng)菌落計數(shù)方法相比,兩種檢測方法檢測結(jié)果差異不顯著（p0.05）;用此試劑盒對自制含雙歧桿菌的乳粉產(chǎn)品（1）進(jìn)行檢測時,與傳統(tǒng)菌落計數(shù)方法相比,兩種ELISA試劑盒檢測方法檢測結(jié)果差異顯著（p0.05）。
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